一、使用注意事项：

1、细胞数建议不超过300万，最多不超过500万，否则可能会堵塞离心柱。当细胞数较多时（例如使用6cm dish），裂解后可以先12000g离心1分钟，然后取上清加等体积乙醇，充分混匀后上柱；

2、如果加入乙醇后有显著的沉淀产生，则用枪吹打，将沉淀吹至看不见为止，然后上柱；

3、4000g离心1分钟后，如果柱子中仍然有液体残留，可以用12000g离心；

4、对于细胞量很少的样品，或者对RNA产量要求较高的情况：

实验开始前可以先把洗脱液放到65度，加入洗脱液后，可以室温放置1~2分钟，使RNA充分溶解，然后离心，然后再将得到的RNA加入柱子中放置5分钟，重复洗脱一次。

5、洗脱液的体积不可太少或太多，建议通常加20~30微升洗脱液即可。

6、如果实验对极少量的基因组残留很敏感，可以在4000g离心后，用随试剂盒附赠的DNA酶处理：每个样品的柱子中央加入12 ul稀释好的DNase（按照2 ul DNA酶+10 ul ddH2O的比例稀释，用枪吹打混匀）

二、常见疑问解答

1、这个试剂盒能不能加入裂解液以后先冻存起来，等到样品都收集齐了再一起做？
答：细胞样品可以加入裂解液后，充分混匀，vortex震荡使细胞充分裂解，然后冻存于-80度。理论上能保存的时间跟TRIzol保存的时间相当。具体操作如下：

（1）弃去培养基，加200微升PBS，轻轻摇晃几下培养皿，弃去PBS。

（2）加500ul裂解液到孔板里，吹打10下，放置1分钟，吸出来到1.5毫升EP管里冻存在-80度。可以放置3个月。操作过程中如果样品多，可以分批操作，以免细胞被晾干导致细胞死亡RNA降解。

2、这个试剂盒能提的最小细胞量是多少？

答：常规的细胞（如293T等及常见的细胞，如癌细胞等），最低5万个就可以提出RNA，更少的细胞数需要自己尝试做优化。对于T、B细胞等免疫细胞，由于其体积远小于常规细胞（大约只有常规细胞的几十分之一），因此能提取的最低细胞数需要明显增加，最低需要100万以上。

3、关于组织RNA的提取，有什么需要注意的吗？

答：本试剂盒提取细胞样品的RNA最简便，提取组织样品时有一定的局限，只能提取内脏组织、肿瘤组织等相对易于裂解的组织。提取组织样品时，样品用量不可过多，建议用5mg组织。充分匀浆后，需要vortex振荡，然后在室温放置5分钟，以使组织充分裂解，然后离心，将上清转入新的EP管，加等体积无水乙醇混匀，上柱。

4、怎样操作能得到尽量多的RNA？

答：（1）首先细胞数需要合适，通常6孔板或35mm培养皿，细胞培养至90%以上的密度最佳。（2）PBS清洗细胞时，轻柔晃动几下培养皿即可（注意勿吹打，以免丢失细胞），充分吸净PBS后，加入裂解液。如果样品较多，建议每吸去2个孔就加入裂解液，不要让细胞处于没有液体覆盖的情况下超过1分钟，否则细胞极易被晾干导致快速死亡，从而导致RNA大量降解。建议在干净的实验台上操作，不要在有风吹的超净台操作，以免液体蒸发过于迅速。（3）加入裂解液后，吹打10次左右，可以在室温放置1~2分钟，以充分裂解细胞，然后吸到EP管中，vortex，加等体积无水乙醇。（4）洗脱时，可以先将洗脱液预热到65度，然后加入20~30 ul到离心柱的膜中央，室温放置1~2分钟，然后上柱离心。然后可以将液体再次加回到离心柱中，放置5分钟，离心。（5）RNA的产量取决于细胞量，最多能提40 ug。

5、这个试剂盒的基因组DNA是如何去除的？

裂解后，加等体积无水乙醇上柱时，硅胶膜能够相对特异性的吸附RNA，绝大部分DNA和蛋白自等杂质会被离心下去，RNA留在膜上。再用可选步骤中的DNA酶处理，能够进一步去除基因组。如果qPCR引物来自参考文献或设计qPCR引物时采用了跨内含子的设计，则无需DNA酶处理也可，因为目前文献中常用的引物基本都是跨内含子设计的（内含子长度通常较长），在qPCR的条件下，只能检测到cDNA的表达，而不会检测到基因组，因此即使模板中有少量的基因组残留也检测不到，不会对结果产生影响。

 

使用RN001进行革兰氏阳性菌的RNA提取步骤：

1、 12000g离心2分钟，用移液器弃去上清，收集菌体。

2、 加入10 mg/ml溶菌酶150 μl，涡旋重悬菌体，37℃酶解30分钟。

3、 上述反应结束后，加入500 μl的裂解液，用移液器吹打20~30次左右，室温放置5分钟使之充分裂解。

4、 向上述裂解产物中加入等体积的无水乙醇，充分混匀后，上柱，按照说明上的步骤继续后续的操作。

5、 一定要进行DNA酶处理。